案例二

应用实例


2018年1月18日,国际学术刊物Nature子刊肿瘤学专业期刊《Oncogene》杂志在线发表了中山大学附属第一医院张弩副教授科研团队的又一篇circRNA翻译功能性蛋白的文章,题为“A novel protein encoded by the circular form of the SHPRH gene suppresses glioma tumorigenesis”的研究论文。




研究团队发现由抑癌基因SHPRH的26-29四个外显子形成的环状RNA分子具有编码蛋白的能力,环状RNA编码的小蛋白可以充当母基因的“保镖”,通过泛素化途径保护全长母蛋白,从而发挥抑制肿瘤的作用。LncRNA及circRNA作为可翻译RNA也少量报道,这些报道揭示了这类RNA作为可编码RNA在机体中扮演新的重要角色,刷新了我们对于“非编码RNA”认识。本研究发现的环状RNA 分子更具特色,就像研究团队说的“Interestingly, the translation pattern of circ-SHPRH is quite similar to that of the covalently closed circular (CCC) RNA of the virusoid associated with rice yellow mottle virus ”发现的来自高等生物人类的RNA分子,也能像病毒的RNA分子一样利用重叠的密码子精打细算的翻译蛋白质发挥重要的生物学功能,此发现在国际上尚属首次。本报道对于环状RNA的生物学功能机制研究具有重要的意义。


此项研究得到中国快频彩app官网下载最新地址重点研发计划青年科学家项目“环状RNA翻译蛋白质的调控过程与生物学功能”等项目的资助,所有工作均在中国独立完成。文章第一作者为研究助理张茂雷、助理研究员黄努努博士、杨雪松博士和罗景燕博士, 通讯作者张弩教授主攻方向为中枢神经系统肿瘤的临床与转化研究,前期已获得快频彩app官网下载最新地址自然科学基金、广东省特支计划青年拔尖人才、广东省自然科学杰出青年基金等基金的支持。下一阶段,团队将继续围绕环状RNA翻译蛋白质这一领域进一步探索,为环状RNA编码的蛋白质在恶性胶质瘤以及其他恶性肿瘤中的作用提供全新的参考,并探索这一类环状RNA及其编码的蛋白质在恶性肿瘤诊断、预后及靶向治疗的前景。


山人认为该文相比之前的研究又进了一步,首次发现了人类环状RNA分子可以像病毒RNA分子一样可以利用重叠密码子进行翻译蛋白质,发挥重要的生物学功能,新意突出!下面就让我们通过拜读这篇大作,一起学习下。

1.锁定要研究的目标circRNA分子


Fig.1 环状RNA circ-SHPRH发现识别鉴定(来自[1])


作者通过对脑胶质瘤临床组织标本进行circRNA深度测序及生物信息学分析挖掘,发现了一些在脑组织以及癌旁组织中有明显表达差异的circRNA,研究者通过对大样品进行基因检测发现环状RNA circ-SHPRH基因在脑肿瘤中明显表达降低。circ-SHPRH是源于母基因 SHPRH的第 26—29的4 个外显子环化形成的 440nt的环状 RNA分子。研究者通过sanger测序、Northern blot、FISH等常规实验技术手段证实了circ-SHPRH内源性的客观存在及亚细定位。

2.怎么证实circRNA翻译蛋白质?


Fig.2a 环状RNA circ-SHPRH翻译蛋白质的发现(来自[1])


作者通过分析发现在circ-SHPRH中存一个非常有特点类似水稻黄斑病毒(rice yellow mottle virus (sobemovirus) (RYMV))的翻译开放阅读框(ORF),阅读框中采用了‘UGAUGA’重叠的密码子起始和终止翻译(双终止子),和病毒的非常类似的现象发生在高等生命体中,整个环状RNA 可以说没有浪费一个核酸碱基,让人惊叹,生物是多么的精打细算利用有限的资源!


补充了解:Rice yellow mottle virus (sobemovirus) (RYMV) 的拟病毒可造成水稻黄斑病变。该病毒由220nt的闭合环状RNA构成,RYMV编码蛋白的机制非常有特点,我们可以分析发现其中玄妙之处:如果220nt全部作为密码
子,最多可编码73个氨基酸,按照每个氨基酸分子量110估计,73个氨基酸最多只有8kD左右大小,实际情况是该拟病毒编码了一中16kD的蛋白!玄妙之处在于它采用了一种重叠编码的策略,就是在第一次走完环状RNA全部序列之后在起始密码子前的一个碱基和起始密码子的“AU”继续作为ORF的密码子进行第二轮编码,再次到达起始位点的时候,原先起始密码子的“A”与前面的两个碱基“UG”构成了第一终止密码子,后面还有第二和第三终止密码子存在,因此个别情况下还会表达出18kD或23kD大小的蛋白。这一文章的发现非常奇特,也只有在环状的分子形式才可能出现重叠密码子的情况。


Fig.2b 环状RNA circ-SHPRH翻译蛋白质的发现(来自[1])


另外研究者在人的circ-SHPRH分子中发现内部存在高度保守的核糖体插入位点序列(IRES),并用双荧光素酶系统证明了其活性。   Circ-SHPRH通过首位相接形成了一个环RNA分子,然后翻译146个氨基酸的小的蛋白质,作者通过构建circRNA系列表达载体以及制备特异性检测circRNA翻译蛋白的抗体并且结合质谱检测的手段,证实了circ-SHPRH RNA 翻译了一个大约17KD的小蛋白质。


3  circ-SHPRH翻译的蛋白质协同母基因发挥生物学作用

Fig.3 环状RNA circ-SHPRH翻译蛋白质分子机制(来自[1])

母基因SHPRH蛋白是一种E3泛素连接酶,能特异性介导PCNA的泛素化降解过程。作者首先尝试在细胞系中过表达SHPRH-146aa,并分析了对PCNA的影响情况,发现过表达SHPRH-146aa后也会减少PCNA的蛋白表达量,但不影响PCNA的RNA量,这说明SHPRH-146aa与全长SHPRH类似,也对蛋白泛素化作用通路有影响。蛋白酶体抑制剂MG132能缓解过表达SHPRH-146aa的作用,因此将SHPRH-146aa的作用机制聚焦在泛素化作用通路上。


更有趣的是,过表达SHPRH-146aa后,全长的SHPRH蛋白也增多了,但其RNA并没有受到影响,干扰SHPRH-146aa后SHPRH全长蛋白也跟着降低了,RNA并未受到太大的影响,同时PCNA蛋白也增高了。这些结果暗示SHPRH-146aa或许通过稳定全长SHPRH蛋白而发挥作用。验证这一假设的有效实验是通过添加放线菌酮(CHX)阻断新蛋白的合成,看随着时间延长,内源全长SHPRH蛋白的变化情况。实验结果证明了上述的假设,过表达SHPRH-146aa的确延长了全长SHPRH蛋白的半衰期。CoIP实验也证明了   SHPRH-146aa和全长SHPRH存在相互作用。通过进一步的发现,研究者发现全长母基因表达的蛋白SHPRH也是受泛素化修饰然后受到降解,环状RNA circ-SHPRH表达的小的蛋白质能有效的保护全长母基因,提高母基因全长蛋白的稳定性,我们感叹细胞太聪明了,“小蛋白能为母亲挡子弹,保护母亲全长蛋白免受降解”


4.作者分析了临床标本中SHPRH-146aa的表达量及在细胞动物模型中证明SHPRH-146aa对胶质瘤成瘤性的影响情况。结果显示环状RNA SHPRH翻译的小蛋白质对肿瘤的生长有明显的抑制作用。

Fig.4 环状RNA circ-SHPRH翻译蛋白质生物学功能及临床意义(来自[1])


本文的工作再一次证实了来自高等生物的环状RNA 可以像病毒分子一样翻译具有生物学功能的蛋白,更是首次报道人类内源性的circRNA分子可以利用重叠密码子翻译蛋白。(重叠密码子使用的现象偶尔会见到在病毒等低等生物的基因组中),那么类似的现象会不会还在其他circRNA中存在?高等生物中存在的海量环状RNA分子还具有那些重要的生物学功能?以前传统的认识需要陆续被研究者打破,期待我们科研工作者的研究来揭示生命的深层次奥秘,为人类的健康事业做出贡献~


参考文献:
1. Maolei Zhang, N.H., Xuesong Yang, Jingyan Luo, Sheng Yan, Feizhe Xiao, Wenping Chen, Xinya Gao, Kun Zhao, Huangkai Zhou, Ziqiang Li, Liu Ming, Bo Xie, Nu Zhang, A novel protein encoded by the circular form of the SHPRH gene suppresses glioma tumorigenesis. Oncogene, 2018.

2.  AbouHaidar, M.G., Venkataraman, S., Golshani, A., Liu, B., and Ahmad, T. (2014). Novel coding, translation, and gene ex pression of a replicating covalently closed circular RNA of 220 nt. Proc Natl Acad Sci U S A.



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