案例一

应用实例




背景:

环状RNA是新发现的非编码RNA,半衰期长、在体液和组织中含量丰富,是非常有临床应用前景的诊断分子标志物。大量的环状RNA功能及调控机制还未被研究。

目的:

研究新发现的环状RNA在肝癌中的作用及调控机制。

circZKSCAN1ZKSCAN1的关系结果


1、在肝癌组织中表达下调


前期高通量测序结果发现circZKSCAN1在肝癌组织中表达下调,并通过环性验证三手段(RT-PCRsanger测序、RNase消化QPCR)验证了其环性。并且产自同一母基因的大哥ZKSCAN1蛋白表达也下调。

2、表达下调与肝癌的不良预后密切相关

这两兄弟同时在肝癌中下调预示着什么呢?

▲ 通过对102对肝癌样本的表达检测数据分析发现,circZKSCAN1的表达下调与肝硬化、肿瘤数量增多、侵袭能力增强和TNM分期不良密切相关,而大哥ZKSCAN1的表达下调与肝癌的肿瘤变大有关。且ROC曲线分析表明 circZKSCAN1预示肝癌发生的敏感性和特异性分别是82.2%72.4%,这说明circZKSCAN1的表达能作为区分癌和正常组织的分子标志物。而其大哥ZKSCAN1的就没这么好了,再一次验证了circRNA的稳定性和应用潜力。


3、两者的表达互不干涉

既然这两兄弟在肝癌中同时下调,那么是不是能相互调控呢?

▲ 通过构建稳定过表达和干扰circZKSCAN1ZKSCAN1表达的肝癌细胞株,QPCR结果发现对另外一个的表达无影响。看来这两兄弟的独立性很强,很可能是各干各的。



4、调控肝癌细胞的发生发展

这两兄弟究竟能干出什么大事呢?

▲ 通过对circZKSCAN1ZKSCAN1稳定过表达和干扰表达的肝癌细胞株进行常规肿瘤功能检测,结果发现两兄弟的过表达抑制肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭,而干扰表达后肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力增强了。动物实验也获得了相同的结果。说明这两兄弟干的是抑制肿瘤发生的好事,而肿瘤的发生发展过程中这两兄弟的表达却下调了。





5、调控肝癌进展的机制研究

既然这两兄弟的表达下调能促进肝癌进展,那么他们下调后是哪些基因的表达发生了变化呢?

▲ 通过RNA-seq结果发现circZKSCAN1干扰表达后有372个差异表达基因,干扰ZKSCAN1的表达后有346个基因的表达发生了变化,其中相同的表达变化基因有166个,有一半以上的差异表达基因是不同的。




▲ 运用KEGG信号通路分析发现circZKSCAN1的下游主要是PI3K、迁移、细胞骨架、粘附和细胞因子互作信号通路,而ZKSCAN1的下游主要是代谢信号通路。这一结果说明这两兄弟表达下调果然是通过不同的调控机制发挥促癌作用的。最后用QPCR证实了部分差异表达基因。


circRNA研究经验总结


1.高通量测序筛选差异表达circRNA;

2.研究与癌症相关母基因的circRNA;

3.分析病理特点和预后样本量一定要大,本文是102例;

4.RNA-seq找差异表达基因是分析下游机制的好方法。

















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