文献解读 | 环状RNA VMA21通过靶向调控miR-200c和XIAP防止椎间盘突出

2018-12-21

环状RNA VMA21通过靶向调控miR-200c和XIAP防止椎间盘突出

摘要

circRNAs可以作为竞争性内源RNA发挥作用与microRNAs(miRNAs)相互作用并影响miRNA靶mRNA的表达。circRNA是否可以作为竞争性内源性RNAs调节椎间盘退变(IVDD)的病理过程有待研究。

方法

在IVDD中,采用自患者的NP细胞(nucleus pulposus Cells,NPc)和退行性NP组织和大鼠模型研究circ-VMA21。研究了circ-VMA21与miR-200c以及其靶基因X连锁抑制剂 -检测凋亡蛋白(XIAP)的相互作用。

结果

炎症细胞因子处理NP细胞抑制XIAP的表达。退行性的NP组织与过度凋亡和细胞外基质的合成代谢因子与分解代谢因子之间的不平衡直接相关。mir-200c通过抑制XIAP调节NP细胞活性和功能。在NP细胞中circ-VMA21充当了miR-200c海绵通过靶向miR-200c和XIAP发挥作用。椎间盘内注射circ-VMA21减轻大鼠模型中的IVDD。

结论

Circ-VMA21可以通过miR-200c-XIAP途径减轻炎症因子诱导的NPc凋亡和细胞外基质合成代谢和分解代谢之间的失衡。它提供了一个IVDD可能有效的治疗策略。

前言

有充分证据表明腰背部痛是残疾的主要原因,其主要是由椎间盘(IVD)变性,一种退行性椎间盘的疾病引起的。椎间盘由内核组成髓质(NP)并被纤维环包围。髓核细胞(NPC)是一类驻留在NP中细胞并负责合成细胞外基质(ECM),例如II型胶原蛋白(胶原蛋白II)和聚集蛋白聚糖。这些蛋白质是IVD保持椎间盘高度和对抗多种外部机械压缩的要的功能组合物。多种异常刺激可以增加NP中的炎症因子{例如白细胞介素-1β(IL-1β)和细胞因子)肿瘤坏死因子-α(TNF-α)},然后诱导NPC的合成代谢和分解代谢之间的不平衡,例如增加分解代谢因子(如基质金属蛋白酶)(MMP)和去整合素和金属蛋白酶血小板反应蛋白基序(ADAMTS))和抑制合成代谢因子的表达(如胶原蛋白II和聚集蛋白聚糖),以及过度的NPC凋亡。这些不利因素引发或加速椎间盘突出椎间盘退变(IVDD).因此,有必要找到抑制NPC凋亡的有效方法,减弱炎症反应,扭转NP微环境不平衡合成代谢与分解代谢之间的关系。


微小RNA(miRNA)很小,单链,非编码RNA分子,通过直接与靶mRNA的3'非翻译区(UTR)抑制蛋白的产生。miR-200c通常与各种癌症有关,通过阻断上皮细胞向间充质细胞转变,表现出肿瘤抑制的功能。此外,最近的研究也有揭示其靶向不同的mRNAs诱导细胞凋亡的能力。此外,miRNAs作为调控基因表达在预防和治疗IVDD发挥重要作用。


环状RNA(circRNA)是另一种类型没有5'-3'极性的环结构和多腺苷酸化的尾巴的RNA。大多数circRNAs是内源性非编码RNA,不同物种之间的表现更高是保守的,稳定程度比线性mRNAs高,它们主要由一个或多个外显子通过反向剪切机制形成。虽然circRNAs具体生物发生尚不完全清楚,但通过在侧翼内含子序列之间进行配对可以找到了一个可靠的环化驱动模型。例如,互补的Alu重复元素在侧翼内含子内促进形成外显子衍生的circRNAs 最近,一些circRNAs已被证明富含miRNA结合位点,并作为竞争内源RNA(ceRNA)与miRNA相互作用并影响靶mRNA的表达。


到目前为止,尚不清楚circRNA是否可以充当ceRNA来调节NPC活力和功能,以及IVDD的病理过程。在这项研究中,我们鉴定了一种来自VMA21的circRNA(名为Circ-VMA21;也称为hsa_circ_0091702在NP中的CircBase(http:// www.cirbase.org))并系统地研究了它在细胞和细胞中的作用IVDD的动物模型。


miR-200c在退行性NP组织中上调参与NPC活力和功能的调节

使用来自NCBI的生物技术信息综合数据库(GSE45856)研究退行性NP组织中miRNA在的差异表达。通过miRNA芯片技术检测到2672个miRNA,14种miRNA在退行性NP组织表达上调(图1A)。使用定量实时逆转录PCR分析候选miRNA表达。使用上述标准,观察到miR-200c,miR-130b-5p和miR-2355-5p在退行性NP组织中显着上调比较,其中miR-200c具有最高水平的上调(图1B)。这些miRNA在大鼠模型的表达变化与IVDD患者的表达一致(图1C)。 Northern印迹也证实了在退行性NP组织中的miR-200c水平(图1D)。

因此,选择miR-200c用于进一步分析

进一步研究NPC中过表达miR-200(图1E)促进细胞凋亡(图1F),同时caspase活化升高, MMP-3,MMP-13,ADAMTS-4和ADAMTS-5表达升高,并且抑制胶原蛋白II和聚集蛋白聚糖的表达(图1G)。这些结果表明在NPC中miR-200c具有促凋亡和促进代谢作用。应用TNF-α/IL-1β处理,NPC中miR-200c水平增加,miR-200c拮抗剂可以抑制其水平(图1H)。TNF-α和IL-1β处理增强细胞凋亡和ECM代谢反应的变化,而抑制miR-200c减弱这种效应(图1I,J)。因此,功能丧失和失效实验表明miR-200c是NPC的生存和功能的负面调控因子。

(图1)

mir-200c通过抑制XIAP调节NPc活力和功能

生物信息学预测结果表明,XIAP是细胞凋亡途径调节因子,也是miR-200c的潜在靶点(图2A)。Gene ontology(GO)分析揭示了退行性NP组织中上调的miRNA和细胞凋亡信号通路的调节之间的相关性。荧光报告系统结果表明miR-200c抑制野生型XIAP报告基因活性,而miR-200c对突变的XIAP报告基因活性没有影响(图2B)。在退行性NP组织中观察到XIAP(图2C)。在NPC中miR-200c水平升高抑制XIAP表达,而内源miR-200c的敲低增加XIAP表达(图2D)。TNF-α/IL-1β处理抑制NPC中的XIAP蛋白表达,而miR-200c拮抗剂减弱这种效应(图2E)。此外,我们研究了在NPC中是否miR-200c与XIAP的功能相关。结果显示XIAP敲低诱导NPC凋亡,加剧了分解代谢反应并降低了ECM的表达。进一步结果表明,敲除XIAP显着抵消了miR-200c拮抗剂在TNF-α/IL-1β处理NPCs的影响(图2F,G),表明miR-200c通过XIAP发挥其功能.

(图2)

Circ-VMA21作为miR-200c的海绵

starBase预测了多个具有miR-200c结合位点的circRNA然后根据评分筛选了前20个circRNA。使用特定的不同引物通过qRT-PCR检测分析所选择的circRNAs 在NP样品中的存在。(图3A,上图)然后通过测序进一步确认(图3A,下图)。通过qRT-PCR分析表明在退行性NP组织中Circ-VMA21表达水平显著下调(图3B)。这个结果也通过RNA荧光原位杂交(FISH)证实(图3C)。退行性NP组织中Circ-VMA21表达水平与XIAP表达水平呈正相关。

为了研究Circ-VMA21是否可以被miR-200c限制,我们使用RNAhybrid将Circ-VMA21的序列与miR-200c的序列进行比较,并发现Circ-VMA21包含六个miR-200c的结合位点(图3D)。其中,通过荧光素酶测定验证了五个位点(图3E)。该circRNA丰富且对RNase R具有抗性与mRNA相比的治疗(图3F)。 Northern blot analysis显示线性VMA21可通过线性探针检测到,但circRNA探针检测不到环化位点(图3G)。Pull-down测定揭示了Circ-VMA21富集更多的miR-200c对比破坏了miR-200c与Circ-VMA21结合的突变的miR-200c(图3H)。 Circ-VMA21源自VMA21基因的最后一个外显子,主要转录mRNA的3'UTR。CircInteractome表明其拥有69个Argonaute 2(AGO2)蛋白质的结合位点。交联和免疫沉淀(CLIP)序列显示至少30个AGO2结合区位于VMA21 mRNA的3'UTR。其中,五个区域与miR-200c结合位点重叠(图3I,上图)。结果表明AGO2免疫沉淀内源性Circ-VMA21,用AGO2拉下来了富含转染miR-200c而不是其突变体(图3I),表明miR-200c促进了AGO2和Circ-VMA21之间的结合。 Northern印迹分析显示miR-200c反向pull-down可以获得Circ-VMA21(图3J)。 RNA FISH发现Circ-VMA21和miR-200c在NPC的细胞质中共定位(图3K)。我们的结果表明NPC中Circ-VMA21能够直接结合的miR-200c。

(图3)

Circ-VMA21通过靶向mir-200c和XIAP调控NPC功能

采用被携带Circ-VMA21、线性VMA21腺病毒,以及Circ-VMA21 siRNA或对照siRNA感染NPC。 qRT-PCR的结果显示感染腺病毒Circ-VMA21导致NPC中过表达Circ-VMA21和siRNA抑制Circ-VMA21表达(图4A)。敲除VMA21 mRNA没有影响Circ-VMA21水平。同样,Circ-VMA21 siRNA对mRNA表达没有影响。 Northern blot anal-ysis也证实了摄入外源性Circ-VMA21之后Circ-VMA21的表达升高(图4B)。然后,通过蛋白质印迹检测Circ-VMA21对XIAP表达的影响。 Circ-VMA21的上调增加了XIAP表达,而Circ-VMA21敲低减少XIAP表达(图4C)。对Circ-VMA21的上调抵消了miR-200c对XIAP表达的抑制作用(图4D)和启动子活性(图4E)。这些在一起结果表明Circ-VMA21充当功能性海绵miR-200c调节XIAP表达和启动子活性。接下来,我们研究了Circ-VMA21在TNF-α/IL-1β处理过的NPC功能。炎症因子处理后,qRT-PCR分析发现Circ-VMA21减少和miR-200c水平的增加,这可以通过对Circ-VMA21的上调来扭转(图4F,G)。结果表明,过表达Circ-VMA21抑制了细胞凋亡和分解代谢的作用,促进了胶原蛋白II和II的表达、聚集了蛋白聚糖(图4H,I)。此外,我们探讨了XIAP是炎症因子处理的NPC中Circ-VMA21的下游基因。我们共同转染了Circ-VMA21和XIAP siRNA,并观察到Circ-VMA21对NPC活力和功能的影响减弱了(图4J,K)。这些数据表明Circ-VMA21通过靶向mir-200c和XIAP调控NPC功能。

(图4)

椎间盘内注射Circ-VMA21腺病毒减轻了大鼠的IVdd 

我们通过针穿刺成功建立了IVDD大鼠模型(图5A)。在穿刺后1周和5周,使用33号细针将人腺病毒Circ-VMA21注射到IVD。在所有IVD穿刺组中,X射线处理1,5和9周显示进行性椎间盘间隙随着时间的推移缩小范围。在Circ-VMA21组和非注射或Circ-VMA21-mut组中每一个注射后的时间点,椎间盘高度指数的百分比(%)记录无明显差异(图5B,C)。注射 9周后,IVD的MRI变性评分Circ-VMA21组明显低于非注射组(图5D,E,)。体内RNA FISH发现Circ-VMA21位于NP区域(图5F)。之后注射腺病毒Circ-VMA21,cirvMA21水平在退行性NP组织显着升高,而miR-200c的水平降低(图5G,H)。注射腺病毒Circ-VMA21减轻了NP的退行性变化。诸如增强的凋亡和分解代谢反应,在IVDD大鼠模型中减少ECM组成(图5I,J,K)。 非注射组的逻辑评分比9周时的Circ-VMA21组显着更高(图5L,M)。

总之,这些结果揭示了Circ-VMA21水平升高的积极作用,减弱NPC凋亡,抑制ECM分解代谢,促进NP中的合成代谢和在体内缓解IVDD结果。

(图5)

总结

多个证据表明某些miRNA可以针对与发育有关的不同基因参与IVDD的进展,并在调节NPC活力和功能方面发挥重要作用。在这项研究中,首先确定了miR-200c是参与IVDD的关键miRNA。 miR-200c参加了促凋亡反应和合成代谢和分解代谢因子不平衡表达。然后调查潜在影响NPC中的miR-200c的circRNAs。结果显示Circ-VMA21通过捕获miR-200c来显著降低miR-200c的活性压制了miR-200c的功能。因此,提出了一种机制Circ-VMA21吸收miR-200c抑制NPC凋亡,促进ECM合成代谢并抑制ECM分解代谢,并因此延迟了IVDD的进展。

本研究,qRT-PCR,northern blot和FISH检测在NPC中揭示了丰富的Circ-VMA21。Circ-VMA21是由VMA21基因的第三个外显子的反向剪接产生的。生物信息学分析发现Circ-VMA21含有多个miR-200c目标位点,经荧光素酶验证,pull down,RNA结合蛋白免疫沉淀RIP和FISH分析。此外,Circ-VMA21正调节miR-200c靶标的表达mRNA,XIAP。因此,Circ-VMA21对miR-200c的结合位点是证明有效。

(图6)

点评

(1)研究者完美的规避了circRNA ceRNA研究的弱点,发现的circRNA含有6个miRNA结合位点是该circRNA作为核心作用分子的标配!

(2)circRNA在非癌类疾病是大有可为的,只要找对方向!

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